LE PRELEVEMENT: 1 LITRE D'EAU

A-Nature du prélèvement:voir flacon
1-Eau prélevée sur les réseaux d'eau chaude sanitaire:
-soit au réservoir ou au ballon de stockage d'eau chaude ou au robinet d'eau chaude le plus proche (permet d'évaluer la qualité d'un réseau).
Flamber le robinet et laisser couler avant de faire le prélèvement pendant 1 minute minimum et jusqu'à ce que la température se stabilise
Prélèvement sur flacon de 1 litre contenant 20 mg de thiosulfate
Remplir le flacon jusqu'au col
Préciser le lieu de prélèvement sur la fiche de prélèvement
Noter éventuellement la température de l'eau
-soit sur des douches, des douchettes ou des robinets d'eau chaude (permet d'évaluer la contamination des canalisations et la qualité de l'eau au point d'usage)
Faire le prélèvement en priorité sur des douches, des douchettes sinon des robinets d'eau chaude
Ne pas flamber ni faire couler l'eau chaude ni démonter les pommes de douche et les brise-jet
Prélèvement sur flacon stérile de 1 litre contenant 20 mg du thiosulfate
2-Eau prélevée sur les installations de climatisation:
Prélèvement sur flacon de 1 litre contenant 20 mg de thiosulfate et dans un emballage stérile
Plonger le flacon dans un bac de condensats ou de récupération des laveurs d'air
Préciser le lieu de prélèvement sur la fiche de prélèvement
3-Eau prélevée dans les piscines:
Se laver soigneusement les mains
Prélèvement sur flacon de 1 litre contenant 20 mg de thiosulfate et dans un emballage stérile
Remplir le flacon par trempage dans le bassin

B-Conservation et transport du prélèvement:
-température ambiante
-à protéger des rayons du soleil
-l'ensemencement doit être effectué dans les 48 heures

L'ANALYSE (selon la norme T 90-431):   voir matériel
A-Préparation du concentré:
-Filtrer 1 litre d'eau sur la membrane en polycarbonate placée sur une rampe de filtration
-Introduire la membrane dans un flacon type CBU stérile avec 5 ml de l'eau à analyser (la membrane doit être immergée)
-Placer le flacon CBU (1 flacon par série) dans la cuve à ultra-sons pendant 4 minutes : le niveau de diluant couvrant la membrane doit être inférieur au niveau de l'eau contenue dans la cuve à ultra-sons.
-Obtention du concentré
1-Traitement thermique: (permet de réduire ou éliminer les bactéries interférentes)
Placer dans un tube stérile:
-le concentré......... 2 ml
-incuber 30 mn à 50°C
-ensemencer immédiatement (voir B)
2-Traitement acide: (permet de réduire ou éliminer les bactéries interférentes)
Placer dans un tube stérile:
-le concentré......... 2 ml
-tampon pH 2,0........ 2 ml
-incuber 5 mn à température ambiante
-ensemencer immédiatement (voir B)
B-Ensemencement de 5 milieux Legionella sélectif (GVPC) par technique d'étalement avec:
-200 µl de l'échantillon pur soit E 1
-200 µl de l'échantillon dilué au 1/10 dans le tampon PBS (0,5 dans 4,5 ml) soit E 2
-200 µl de l'échantillon concentré ayant subi le traitement acide soit E 3
-100 µl de l'échantillon concentré non traité soit E 4
-100 µl de l'échantillon concentré ayant subi le traitement thermique soit E 5
Laisser reposer les boîtes jusqu'à absorption des inoculum.
Puis retourner les boîtes et les incuber à 37°C. 
Effectuer des lectures à 3, 5 et 10 jours.
C-Repiquage:
Dénombrer les colonies ayant les caractéristiques suivantes:
-coloration gris bleu pouvant devenir blanchâtre en vieillissant
-bord net et rosé
-aspect de verre frittée à la loupe binoculaire
Repiquer 5 colonies maximum par type de colonies
Nature des milieux à ensemencer pour chaque colonie:
-1 gélose Legionella non sélective (BCYE)
-1 gélose avec 5% de sang de mouton
-1 gélose Légionella sans cystéine (BCYE sans cystéïne)
Incuber  3 jours à 37°C.
Sont considérées comme légionelles les colonies  apparaissant exclusivement sur gélose Légionella non sélective.
Identification par IF et agglutination.
voir aspect des cultures